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万字干货，关于PCR基因扩增仪的一切

2022-02-10 16:44 来源: 周叔说生活

原标题：万字干货，关于PCR基因扩增仪的一切

PCR是分子生物学研究极其重要的工具，是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制，即人为创造核酸半保留复制条件，使目的DNA在细胞外完成扩增的过程，它可被看作是生物体外的特殊DNA复制。

PCR也叫基因扩增仪，主要用于用于科研及临床的基因扩增、定性PCR基因扩增、荧光/酶免终点定量DNA基因扩增、基因芯片等其他基因分析应用的基因扩增等。基因扩增仪适合国内外各种PCR试剂盒传染病类、肿瘤类、科研类。进口基因扩增仪主要由外壳、变温反应腔、散热系统、加热系统、制冷系统、电子控制系统、供电系统、人机界面等各部分组成。基因扩增仪广泛应用于各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。

（如果读完文章您觉得还有哪些想听的知识点小谱没有讲到，亦或是觉得小谱文章中有哪些观点您不太认同，欢迎您积极留言。)

01

“基因扩增仪”的诞生和发展

1983年4月的一个星期五晚上， Kary Mullis开车去乡下别墅的路上,猛然闪现出“多聚酶链式反应”的想法；

1983年12月，Mullis用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的diyi个PCR片段；

在Cetus公司工作期间，发明了PCR。Mullis要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼；

1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202 ），Mullis是diyi发明人；

1985年12月20日在Science杂志上发表了diyi篇PCR的学术论文，Mullis是共同作者；

1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法。

根据PCR原理，商业公司在PCR仪的基础功能上不断进行创新和改进。至今，PCR仪已经更新至第三代技术。为方便读者朋友理解，本文将对三代PCR仪的原理、特点、主要厂商及产品、应用领域做一系统梳理。

第一代——标准PCR仪

▲ 标准PCR反应过程

标准PCR仪也叫做终点PCR仪，是指目的基因仅经过预变性、变性、退火、延伸阶段产生大量的核酸序列的PCR仪，PE-Cetus公司推出的世界上第一台PCR自动化热循环仪属于此种。根据PCR退火温度和扩增条件(细胞内/外)，标准PCR又可以分为三类：普通PCR、梯度PCR和原位PCR。

第二代——qPCR(实时定量PCR)

1996年Applied Biosystems(现被赛默飞收购)公司推出了实时荧光定量PCR(RTFQ PCR)技术，并发明了世界上第一台荧光定量PCR仪，开始了从定性到定量的跨越。

实时定量PCR仪是指在PCR反应体系中加入能够指示DNA片段扩增过程的荧光染料(SYBR Green等)或荧光标记的特异性的探针(TaqMan Probe等)，在普通PCR仪设计基础上增加荧光信号激发和采集系统和计算机分析处理系统，形成了具有荧光定量PCR功能的仪器，通过对PCR过程中产生的荧光信号积累实时监测整个PCR过程，再结合相应的计算机软件对所获得的荧光信号数据进行分析，计算待测样品特定DNA片段的初始浓度。

目前根据荧光信号反应样品浓度主要有两种方法：

1.Taqman探针法

探针两端分别为报告荧光基团R和荧光淬灭基团Q，当探针完整时，R发出的荧光被Q吸收，检测不到荧光信号。探针随机结合到DNA单链上，PCR扩增时，探针被水解，R与Q分离，R发出的荧光就会被检测到。每扩增一条DNA链都会生成一个荧光分子。

2. SYBR Green Ι染料法

SYBR Green Ι是一种只有在和双链DNA结合时才会发荧光的染料。在PCR变性时，无荧光产生，到了复性和延伸阶段则能检测到荧光信号。

实时荧光定量PCR仪主要应用于病原体检测、药物疗效考核、肿瘤基因检测、基因表达研究、转基因研究、单核苷酸多态性(SNP)及突变分析等细分研究方向，广泛应用于临床医学检测、生物医药研发、食品行业等研究领域。

第三代——dPCR(数字PCR)

不同于qPCR 对每个循环进行实时荧光测定的方法，数字 PCR 技术是在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集。

数字PCR是一种基于PCR反应(聚合酶链反应)的单分子绝对定量技术。如图1，在数字PCR的过程中：

(a) PCR反应体系(含有荧光染料或探针)被分割为数以万计的均一微液滴，

(b) 其中部分微液滴内会含有一个或多个模板，

(c) 将这些微液滴收集到试管内进行PCR反应，其中含有模板的微液滴会产生扩增产物，由此具有较强的荧光，成为阳性微液滴，

(d) 在PCR反应完成后，依次对每个微液滴内的荧光进行检测，

(e) 根据微液滴信号的峰值高度，绘制出微液滴荧光分布的散点图，

(f) 通过合理的荧光分类阈值将微液滴内的荧光强度数字化，判断出其中具有较强荧光的阳性微液滴(图1f中绿色的数据点，称为“1”)和具有较弱荧光的阴性微液滴(图1f中蓝色的数据点，称为“0”)，并通过“1”和“0”的个数来实现绝对定量。因此，与实时定量PCR不同，数字PCR不需要使用标准曲线，即可直接对核酸拷贝数的绝对值进行定量。

▲ 数字PCR原理示意图

最后通过直接计数或泊松分布公式计算得到样品的原始浓度或含量。

迄今为止，目前市面上常见的数字PCR仪器主要有两种，根据微反应的形成原理不同，主要分为 “芯片数字PCR”与“微滴数字PCR”两类。

1.芯片数字PCR

▲ 芯片数字PCR原理图

2.液滴数字PCR

▲ 微液滴数字PCR原理图

液滴数字PCR源于乳液PCR( emulsion PCR) 技术，即将DNA模板与连接引物的磁性微球以极低的浓度(比如单拷贝) 包裹于油水两相形成的纳升至皮升级液滴中进行 PCR 扩增，扩增后的产物富集在磁性微球上，收集破乳后进行测序。通过油水两相间隔得到的以液滴为单位的 PCR 反应体系，比微孔板和 IFC 系统更容易实现小体积和高通量，而且系统简单，成本低，因此成为理想的数字PCR技术平台。

数字PCR技术主要应用于不稳定性分析、肿瘤早期研究、产前诊断、致病微生物检测、癌症标志物稀有突变检测等研究领域，也用于验证NGS中的低频突变、 DNA甲基化检测、突变多重检测等方向。

02

“基因扩增仪”的结构和原理

1、结构

外壳、供电系统、电子控制系统、加热系统、制冷系统、散热系统、变温反应腔、外壳以及人机界面等共同构成了基因扩增仪。

2、原理

PCR技术的本质是体外核酸扩增，加热使双链DNA解开螺旋，在退火温度条件下引物同模板DNA杂交，在Taq DNA聚合酶，dNTPs，Mg2+和合适pH缓冲液存在条件下延伸引物，重复 “变性→退火→引物延伸”过程至25～40个循环，呈指数级扩大待测样本中的核酸拷贝数。

3、基因扩增的基本要素

基因扩增的基本要素与DNA复制的基本要素是一致的。

①DNA模板：待拷贝的DNA称为模板，它可以是双链DNA也可是单链DNA，Z后扩增得到的产物是双链状态的。

②引物：是DNA复制的先锋，就象结晶过程中的晶核，引导DNA的合成。在PCR扩增中一般使用合成的寡核苷酸作引物。

③DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)：是DNA复制的动力，在dNTP等底物存在时在引物的引导下沿着模板DNA合成互补的DNA链。

④缓冲液：提供DNA合成反应所需的pH，离子强度等环境。

⑤4种单核苷酸：dNTP，提供DNA合成原料。

4、基因扩增仪原理

基因扩增仪是利用PCR技术对特定基因做体外的大量合成，用于以检测DNA/RNA为目的的各种基因分析。

PCR反应一般设置20~40次循环，每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。每一循环的产物作为下一个循环的模板。PCR的扩增效率很高，如果循环次数是30次，那么新生DNA片段理论上达到230拷贝(约为109个分子)。PCR反应每个循环的三个基本反应步骤如下：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA产物解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备;

②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;

③引物的延伸：温度升到72℃左右，DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

03

“基因扩增仪”的用途和分类

基因扩增仪的用途

基因扩增仪灵敏度高，操作起来简便、快捷，加上对特定基因样本纯度要求低，因而被广泛地运用在以下检测活动中:

1、医学和健康检验机构临床诊断，用于判断检体中是否会表现某遗传疾病的图谱、传染病的诊断以及基因复制。

2、DNA鉴定，常见于司法鉴定领域。

3、临床分子诊断试剂和生物试剂公司药品研发。

4、转基因、微生物、动物源性成分检测，常见于医药卫生及农产品检验领域。

基因扩增仪的分类

1. 普通的PCR仪

一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪，又叫传统的PCR仪。

用途：主要是做一些简单的、对单一退火温度的目的基因进行扩增。

a.梯度PCR仪：一次PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件(温度梯度)，通常为12种温度梯度的普通PCR仪。

用途：研究未知DNA退火温度的扩增。

b.原位PCR：将具有细胞定位能力的原位杂交技术运用于从细胞内靶DNA的定位分析，在细胞内实现基因扩增的普通PCR仪。

用途：用于在细胞的靶DNA所在位置上进行基因扩增。

2. 实时荧光定量PCR仪

PCR扩增时加入的引物利用荧光素进行标记，使引物和荧光探针同时与模板进行特异性结合，扩增结果通过荧光信号采集系统实时采集信号并输送到计算机分析处理系统，实时输出量化结果，这样的PCR仪叫实时荧光定量PCR仪。

a.金属板式实时定量PCR仪

可作为普通PCR仪使用，可带梯度功能，可容纳的样本量大，无需特殊耗材，温度均一性欠佳，有边缘效应，标准曲线的反应条件难以做到与样品完全一致

b.离心式实时定量PCR仪

温度均一性较好，使用的是同一个激发光源和检测器，随时检测旋转到跟前的样品，有效减少系统误差。可容纳样品量少，有的需用特殊毛细管作样品管，增加了使用成本，也不带梯度功能

c.各孔独立控温的定量PCR仪

04

“基因扩增仪”操作规程

普通PCR仪操作规程

1、开机操作

（1）将PCR仪电源开关打开。

（2）将PCR仪顶盖向后平推，然后将PCR薄壁管放进去。

（3）将PCR仪顶盖向前平推，并且均匀用力压下反扣部分。

值得注意的是：9700PCR仪必须使用圆头的PCR薄壁管。

2、关机操作

（1）实验结束后，点击EXit到主界面出现，将PCR电源开关关闭。

（2）均匀用力抬起反扣部分，将PCR仪顶盖向后平推，将PCR薄壁管取出。

（3）将PCR仪顶盖向前平推。

荧光定量PCR仪操作规程

1.开始运行仪器

将PCR仪底座开关打开，再将定量PCR仪检测器开关打开。在实验之前，首先对系统预热半个小时，打开电脑，将iQ5软件启动。

2.放置样品

在0.2ml的薄壁管或96孔板内加入PCR反应体系，将管盖盖上，注意，不要让手指和反应管表面有接触，所以必须将一次性塑料手套戴上。按照顺序在仪器的加热孔中放入反应管。

3.设置程序，运行试验

定量PCR软件的基本操作步骤如下：

（1）对热循环程序文件进行设置。

（2）对反应管文件进行设置。

（3）点击“run”键，将程序运行。

（4）数据分析

4.结果分析

（1）PCR反应结束后，标准曲线和Ct值软件会自动计算。

（2）可以在软件窗口选择相应的分析功能进行表达量分析，等位基因分析。

（3）点击右上方的“Report”键，还能够将结果报告单输出。

5.关闭运行仪器

实验结束后将iQ5软件、荧光定量检测器及扩增系统电源关闭，将电脑关闭，将反应管取出。

05

“基因扩增仪”的常见问题及故障

常见问题

1.为什么在不同型号的PCR仪上扩增出的条带亮度有差异？

答：不同的PCR仪有不一样的优化的升降温策略，因此当向另一类PCR仪转移这类CR仪上使用的PCR步骤参数上时，需要进行试验优化。

2.在PCR实验结束后我的样品可以一直放在PCR仪中低温保存吗？

答：Z好不要，建议在程序运行结束之后，应当将样品从PCR仪中及时取出。当低温保存时，尽量设定比较高的温度，能够使得仪器的使用寿命延长。

3.模拟管和样品台控温模式有什么差别？

若采用样品台控温模式，当将样品台升降温到目标温度时，因为传热延迟，样品管内样品达到目标温度仍需要较长的时间，因此，当步骤时间在30s以下时，Z好使用模拟管控，若要使用样品台控温模式，那么Z好延长一倍步骤时间。

4.反应后反应管壁出现液滴？

可能原因1：在程序运行前，热盖加热功能没有被开启。

方法：将热盖加热功能开启。

可能原因2：在反应结束后，过长时间的低温保存。

方法：在结束运行后，热盖将自动关闭，因此会出现冷凝，这不会影响实验的结果，在离心机上放置反应管，瞬时离心使液滴回到管子底部就行。

5.使用的微孔板，反应后反应液有明显蒸发？

方法：

（1）保证使用的微孔板质量很好，在反应之前，要密封严格。

（2）保证热盖盖紧，将热盖的温度适当提高。

（3）将反应体积增大。

6.使用PCR管，反应后部分PCR管内反应液有明显蒸发？

方法：

（1）确保使用的PCR管质量很高。

（2）将四个同样的空PCR管分别置于样品台的四角，从而使证热盖压在各PCR管上的压力均匀得到保证。

常见故障

1.加热或者冷却速度缓慢

出现这样的情况，原因可能是控制器或机械故障，需要运行诊断测试并记录加热速率。

2.开机时，出现错误信息

这种情况有可能是仪器某一系统启动失败或者电压太低造成的。确保同一电路中没有使用其他电器，不要在已有用电器电路上增设线路。

3.打开电源然而仪器不响应

出现这种情况，很可能是因为插座没有插紧或者电源线脱落，只要重新插入电源就行。

4.屏幕不显示并且马达和风扇不启动

出现这种情况，很有可能是总保险丝被熔断，只要将保险丝更换就能使故障排除。

5.插上电源屏幕空白或，按下某键屏幕不显示相应画面

出现这样的情况，很可能是逻辑电路或者电源的保险丝被熔断，也有可能是因为控制器，对保险丝进行更换，如果不能恢复正常，那么就咨询维修工程师。

06

“基因扩增仪”维护保养及注意事项

尽管PCR仪器不是计量仪器，然而其的作用原理和基本计量要素有很密切的关系，因此，PCR仪需要定期检测和维护。

仪器的维护保养

1．样品池的清洗

首先将盖子打开，然后在样品池加入95%乙醇或10%清洗液，浸泡5min，然后对被污染的孔进行清洗，使用微量移液器对液体进行吸取，使用棉签将剩余液体吸干。打开PCR仪，设定保持温度为50℃使PCR程序运行，挥发去除残余液体，通常只需要5-10分钟左右。

2.热盖的清洗

对于荧光定量PCR仪，若出现荧光污染，并且样品池不是这一污染的来源，或者当热盖的松紧受到污染或残迹物的影响时，垫盖底面需要用压缩空气或纯水清洗，使样品池的孔干净，无污物阻挡光路得到保证。

3.仪器外表面的清洗

对仪器的外表面进行清洗能够使灰尘和油脂除去，然而不能达到消毒的效果，对PCR仪的外表面进行清洗Z好选择没有腐蚀性的清洗剂。

4．更换保险丝

首先关掉PCR仪，将插头拔取，将电源插口旁边的保险盒打开，将备用的保险丝换上，观察是否恢复正常。

仪器的维护和保养的注意事项

1)PCR仪器需要视制冷方式而定通常进行半年至少一次定期检测。

2)PCR反应的要求温度与实际分布的反应温度不相同，如果通过检测，与设置温度相比较，各孔平均温度差超过1～2℃，那么可以对PCR实际反应温度差运用温度修正法来纠正。

3)升、降温过程的时间控制是PCR反应过程的关键时间越短越好，如果PCR仪的降温过程高于1分钟，那么就应该对仪器的制冷系统进行检查。当PCR仪是使用风冷制冷时，其反应底座的灰尘要较彻底地清理，若是其他的制冷系统，那么应该对相关的制冷部件进行检查。

4)通常情况下，如果仪器的温度能够采用温度修正法纠正，那么不要轻易地对仪器的电子控制部件打开或调整。

07

“基因扩增仪”的常见品牌

A. 赛默飞

产品：

Applied Biosystems ProFlex梯度PCR扩增仪

Applied Biosystems ProFlex PCR仪 等

B. 伯乐

产品：

CFX96 Touch 实时定量 PCR 仪

CFX Connect 实时定量 PCR 仪 等

▲ CFX96 Touch 实时定量 PCR 仪

C.天隆科技

产品：

Gentier 96E 实时荧光定量PCR检测系统

D. Eppendorf

产品：

Eppendorf Mastercycler nexus GX2 PCR仪

Eppendorf Mastercycler X50 梯度PCR仪 等

▲ Eppendorf Mastercycler nexus GX2 PCR仪

E. 耶拿

产品：

荧光定量梯度PCR仪

耶拿荧光定量PCR qTOWER384G 等

▲ 荧光定量梯度PCR仪

F.博日

产品：

博日LineGene 9600 Plus荧光定量PCR仪

博日LineGene K Plus荧光定量PCR仪 等

G. STILLA

产品：

▲Naica 6通道微滴数字PCR系统

H. 力康

产品：

力康Trident 960基因扩增仪

力康 T960 PCR仪 等

▲ 力康Trident 960基因扩增仪

I.朗基

产品：

T20型双槽梯度PCR仪

Q2000A型荧光定量PCR系统 等

▲ Q2000A型荧光定量PCR系统

J. 大龙

产品：

大龙梯度基因扩增仪 TC1000-G

大龙实时荧光定量PCR系统Accurate 96 等

▲ 大龙梯度基因扩增仪 TC1000-G

K. 罗氏诊断

产品：

LightCycle96 荧光定量PCR仪 等

L. QIAGEN

产品：

QIAcuity Eight一体化集成数字PCR 系统 等

▲ QIAcuity Eight一体化集成数字PCR 系统

M.雅睿

产品：

▲ 雅睿实时荧光定量PCR仪 MA-6000

N. 宏石医疗

产品：

SLAN-96P实时荧光定量PCR仪 等

O. 安誉科技

产品：

AGT9601PCR扩增仪 等

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